Note publique d'information : Grâce au développement des technologies de métagénomique au cours des dix dernières
années, il a été constaté que les micro-organismes représentent la plus grande ressource
de diversité métabolique et génétique sur Terre. En effet, un gramme de sol contient
109 cellules bactériennes et 103-104 différentes espèces bactériennes. Certaines sont
en mesure de réaliser des réactions enzymatiques conduisant à la dégradation complète
de certains polluants toxiques pour l’environnement comme les composés organiques
tels que la quinoléine. Cependant, l'immense réservoir de molécules et enzymes microbiennes
n'a pas encore été exploité, car plus de 99% d'entre elles ne sont, pour l’instant,
pas cultivables in vitro. Mon travail s’inscrit dans le cadre d’une collaboration
entre l’Université SJTU (Shanghai Jiao Tong Université en Chine) et le groupe de G.
M.E (Génomique Microbienne Environmentale) du laboratoire Ampère à l’Ecole Centrale
de Lyon. Nos partenaires à l’Université SJTU ont construit un réacteur de dénitrification
à l'échelle du laboratoire capable de dégrader la quinoléine en retirant la demande
chimique en oxygène. Un nouvel outil appelé "Genefish" a été developpé dans notre
laboratoire comme une méthode alternative de la métagénomique pour aider à la découverte
de nouveaux gènes d’intérêt industriel ou environnemental. A la suite des premiers
travaux réalisés dans notre laboratoire, ma thèse présentée ici comporte deux parties.Dans
la première partie de ce travail, nous avons étudié le potentiel de dégradation de
la quinoléine présente dans les bactéries d’un sol de référence largement étudié au
laboratoire. Pour cela nous avons mis en place des expériences de microcosme qui visent
à révéler la diversité potentielle des bactéries responsables de la dégradation de
la quinoléine. Des analyses comparatives des profils RISA (Ribosomal Intergenic Spacer
analysis) nous ont permis de mettre en évidence des changements dans la structure
de la communauté des bactéries du sol incubé en conditions aérobie et anaérobie en
présence de quinoléine. La dégradation de la quinoléine a été confirmée par technique
de GC/MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry). Les travaux futurs seront de vérifier
la communauté de bactéries responsables de la dégradation de quinoléine en utilisant
la technique de NGS (Next Generation Sequencing).Le deuxième objectif de ma thèse
a été d'utiliser Genefish dont la finalité est de capturer des gènes ciblés (le gène
bcr qui serait responsable de la degradation de quinoléine dans le réacteur de nos
partenaires) dans l'ADN métagénomique extrait du sol. Genefish consiste à élaborer
une souche d’E.coli incluant un plasmide de capture permettant de pêcher les gènes
recherchés dans un échantillon d’ADN metagénomique par recombinaison homologue. Le
plasmide de capture comprend une cassette de deux gènes toxiques pour la souche qui
activés par induction chimique vont permettre la sélection positive directe des clones
recombinants, et deux sites multiples de clonage dans lesquels sont insérées les zones
de recombinaison qui vont jouer le rôle d’hameçons. Nous avons testé la capacité de
Genefish à capturer des produits PCR du gène bcr, l'efficacité de recombinaison reste
faible à cause de la persistance de plusieurs copies du plasmide suicide dans la cellule
après l’ évenement de recombinaison. Par conséquent, trois stratégies ont été essayées
pour améliorer l’efficacité: la co-électroporation, la ségrégation de plasmide et
la construction de plasmide suicide en mono-copie. Finalement, la stratégie de la
ségrégation plasmidique fonctionne mais l'efficacité de recombinaison est encore trop
faible peut-être due à l’incertitude des modèles de recombinaison homologue. Les travaux
futurs se concentreront sur l'amélioration des fréquences de recombinaison par transfert
de fragments du plasmide de capture dans le chromosome de la souche Genefish.
Note publique d'information : As the development of metagenomic technologies in the past ten years, it is unquestionned
that microorganisms encompass the largest resource of metabolic and genetic diversity
in the world. Actually, one gramme of soil contains more than 109 bacteria and 103-104
species. Some of their members are able to carry out enzymatic reactions leading to
the complete degradation of pollutants (such as quinoline). So, the biodegradation
of some highly toxic or organic compounds by microorganisms will be a general trend
for pollutant treatment. However, the huge reservoir of molecules and enzymes from
microorganisms still need to be explored because more than 99% of microorganisms cannot
be cultivated in vitro.My work was based on collaboration between the University SJTU
and Ecole Centrale de Lyon. Our partners at the University SJTU have built a laboratory
scale denitrification reactor which was capable of degrading quinoline by removing
the chemical oxygen demand. A new tool called "Genefish" has been developed in our
laboratory as an alternative method for metagenomics which aims to discover novel
industrial or environmental genes of interest. Following the early work in our laboratory,
my thesis is presented here in two parts.In the first part, we set up a quinoline
microcosm experiment both under aerobic and anaerobic condition using reference soil
extensively studied in the laboratory at Ecole Centrale de LYON. This work aimed to
reveal the potential bacterial diversity and even genes responsible for quinoline
degradation. We used RISA(Ribosomal intergenic Spacer analysis) to analyze the bacteria
community structure changes and GC/MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) was also
used to detect the quinoline degradation and reveal potential quinoline metabolic
pathways under aerobic and anaerobic condition. Results showed great bacteria community
structure changes and high quinoline degradation activity after the quinoline addition
under aerobic condition. The future work is to investigate the bacteria community
which may be responsible for quinoline degradation using the technique of NGS (Next
Generation Sequencing).The second object of my thesis was to use the Genefish tool
to capture targeted genes (the bcr gene responsible for the quinoline degradation
in the wastewater treatment bioreactor) from the soil metagenome. The aim was to construct
an E.coli strain containing a capture plasmid and Red system for capturing targeted
genes from metagenomic DNA by homologous recombination. The capture plasmid includes
a toxic cassette consisting of two suicide genes which can be activated by chemical
induction, finally support the positive recombinants selection. It also contains two
multiply cloning sites in which highly conserved sequences were inserted and works
as the bait during recombination. We have tested the capacity of Genefish to capture
the PCR products of bcr gene; the efficiency was low because of the persistence of
several copies of the capture plasmid into the Genefish strain after recombination
events. So, three strategies were tried to improve the recombination efficiency: co-electroporation,
plasmid segregation and mono-copy capture plasmid construction. Finally, the strategy
of plasmid segregation works but the recombination efficiency was still low maybe
caused by the uncertain model of homologous recombination. The further research will
focus on the transfer of the toxic cassette and homologous arms into the host strain
chromosome, this new strategy will exclude the bad effect of low copy number capture
plasmid, uncertain model of λ Red induced homologous recombination and the homologous
arms site in the capture plasmid which are the most important factors influencing
the homologous recombination efficiency in Genefish.
paprika.idref.fr
data.idref.fr
Documentation
