Note publique d'information : L'objectif de ce travail de thèse a consisté à étudier la cinnamoyl-CoA réductase
(CCR). Cette enzyme à cofacteur NADPH qui permet la réduction des cinnamoyl thioesters
en aldéhydes, est la première enzyme spécifique de la voie de biosynthèse de la lignine
(polymère végétal hydrophobe). Chez Arabidopsis thaliana, plante modèle, la CCR existe
sous deux isoformes : AtCCR1 impliquée dans la lignification et AtCCR2 intervenant
dans la défense des plantes. Le gène codant pour AtCCR1 a été séquencé pour la première
fois en 2001. Cette protéine a alors été surexprimée dans E. coli. Nous l'avons obtenue
pure pour la première fois et nous l'avons étudiée par cinétique enzymatique en présence
et en l'absence de molécules synthétisées au cours de ce travail, analogues de substrats
ou de l'état de transition de la réaction enzymatique. Connaissant la structure des
substrats, nous avons supposé que certains groupements devaient être présents pour
permettre la reconnaissance du substrat par l'enzyme, notamment un noyau aromatique
possédant une fonction hydroxyle en para, une fonction carbonyle ainsi qu'une liaison
thioester. Nous avons donc synthétisé des analogues de substrats possédant une chaîne
latérale plus ou moins longue mimant la partie pantothénique du coenzyme A. D'autre
part, nous avons synthétisé des analogues de l'état de transition de la réaction enzymatique
en substituant la fonction thioester par une liaison phosphonothioester. Les constantes
de la réaction enzymatique (Km, Kcat) ont été déterminées sur deux enzymes purifiées
: la protéine de fusion AtCCR1-GST et la protéine seule AtCCR1. Les différents inhibiteurs
potentiels ont ensuite été testés sur la protéine AtCCR1. Les tests enzymatiques ont
été pratiqués sur les molécules à chaîne courte (N-acétylcystéamine) et les constantes
d'inhibition ont permis de trouver des inhibiteurs sélectifs dans la série phosphorée.
Nous avons obtenu des résultats prometteurs sur ce sujet qui allie synthèse et biologie,
car les tests enzymatiques sont encourageants et la méthodologie de synthèse simple
à mettre en œuvre pour les molécules porteuses d'une chaîne N-acétylcystéamine.
Note publique d'information : The aim of this PhD work was to study cinnamoyl-CoA reductase (CCR). This enzyme is
NADPH dependent and allows the conversion of cinnamoyl thioesters onto their corresponding
aldehydes; it's the first specific enzyme of the lignin biosynthetic pathway (hydrophobic
plant polymer). In the plant model, Arabidopsis thaliana, CCR exists as two isoforms:
AtCCR1 involved in lignification and AtCCR2 associated to plant defense. The gene
coding for AtCCR1 has been sequenced for the first time in 2001. The protein has been
overexpressed in E. coli to obtain pure AtCCR1, for the first time. Enzyme kinetics
have been run with and without the substrate analogs or transition state analogs synthetized
during this PhD project. According to the substrates structure, we have postulated
that some functions had to be present to allow substrate recognition. For example,
an aromatic ring bearing a para hydroxyl function and a thioester link. Substrate
analogs have then been synthetized bearing a side chain length varying in order to
mimic coenzyme A moiety. Transition state analogs bearing a phosphonothioester link
instead of a thioester one have also been synthetized...
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