Note publique d'information : LA PROTEINE PUS1 DE S. CEREVISIAE CATALYSE L'ISOMERISATION DE L'URIDINE EN PSEUDOURIDINE
() A DIFFERENTES POSITIONS DE CERTAINS ARNT. LE GENE PUS1 A ETE CLONE ET HYPEREXPRIME
CHEZ E.COLI AVEC 6 HISTIDINES EN SON EXTREMITE N-TERMINALE, AFIN DE PURIFIER AISEMENT
LA PROTEINE RECOMBINANTE SUR COLONNE DE NI 2 +-NTA. EN SOLUTION, LA PROTEINE PUS1
RECOMBINANTE EXISTE MAJORITAIREMENT SOUS FORME DE MONOMERES, MAIS SE PRESENTE EGALEMENT
SOUS FORME D'OLIGOMERES ET D'AGREGATS. L'UTILISATION D'UN DETERGENT, LE DODECYL--D-MALTOSIDE,
EST INDISPENSABLE AFIN DE MAINTENIR PUS1 EN SOLUTION, SURTOUT A HAUTE CONCENTRATION
EN PROTEINE. L'INTERACTION DE PUS1 AVEC DIFFERENTS ARNT A ETE ETUDIEE. L'AFFINITE
DE PUS1 EST GENERALE POUR TOUS LES ARNT, QU'ILS SOIENT SUBSTRATS (PRESENCE D'UNE URIDINE
CIBLE) OU NON. LES CONSTANTES D'EQUILIBRE DE DISSOCIATION DES COMPLEXES PUS1 : ARNT
(K D), MESUREES PAR LA TECHNIQUE RETENTION SUR FILTRE DE NITROCELLULOSE, VARIENT DE
15 NM POUR L'ARNT V A L SUBSTRAT, ET L'ARNT P H E NON SUBSTRAT, A 150 NM POUR L'ARNT
I L E SUBSTRAT. L'IMPORTANCE DE L'ARCHITECTURE DE L'ARNT A ETE ETUDIEE AVEC DES MUTANTS
DELETES POUR LES TIGES-BOUCLES T ET D, OU IMPLIQUES DANS LA FORMATION DE PAIRES DE
BASES MAINTENANT SA STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE. BIEN QUE NON NECESSAIRE POUR L'ACTIVITE
DE L'ENZYME, LA PRESENCE D'UNE LIAISON TERTIAIRE G26-A44, ABSENTE DANS L'ARNT I L
E, EST UN ELEMENT IMPORTANT POUR LA RECONNAISSANCE DE L'ARNT AVEC UNE HAUTE AFFINITE
(K D = 15 NM). LA PRESENCE DE CETTE LIAISON TERTIAIRE AUGMENTE LA VITESSE D'ASSOCIATION
DE L'ARNT A L'ENZYME D'UN FACTEUR 100 ENVIRON, RESULTANT EN UNE DIMINUTION GLOBALE
DE LA CONSTANTE D'EQUILIBRE DE DISSOCIATION. CES CONSTANTES ONT ETE MESUREES PAR LA
TECHNIQUE DE RESONANCE DES PLASMONS DE SURFACE. NOUS AVONS DE PLUS MONTRE PAR SPECTROSCOPIE
ATOMIQUE D'ABSORPTION, QUE LA PROTEINE RECOMBINANTE PUS1 CONTIENT UN ATOME DE ZINC
PAR MONOMERE. PUS1 EST LE PREMIER EXEMPLE D'UNE PSEUDOURIDINE SYNTHETASE CONTENANT
UN ION ZINC. UN ENZYME DEPLETE EN ZINC PEUT ETRE OBTENU APRES DIALYSE CONTRE L'AGENT
CHELATANT 1,10-PHENANTHROLINE. LA PERTE DU ZINC RESULTE EN L'INACTIVATION DE L'ENZYME
AVEC LA PERTE CONCOMITANTE DE SA CAPACITE A LIER L'ARNT. ELLE PROVOQUE EGALEMENT UN
CHANGEMENT DE STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE DE PUS1 (DETERMINE PAR ULTRACENTRIFUGATION
ANALYTIQUE), AVEC UN CHANGEMENT MINEUR DE SON ORGANISATION INTERNE (DETERMINE PAR
UVCD, FTIR OU FLUORESCENCE). NOS RESULTATS SONT EN ACCORD AVEC UN ROLE STRUCTURAL
POUR LE ZINC, QUI MAINTIENDRAIT L'ASSOCIATION ENTRE DES DOMAINES STRUCTURAUX DE PUS1.
ENFIN, DANS UN EXTRAIT DE LEVURE, PUS1 EXISTE SOUS DEUX FORMES RECONNUES PAR LES ANTICORPS
POLYCLONAUX ANTI-PUS1 (TECHNIQUE DE WESTERN BLOT) ET DE POIDS MOLECULAIRES AUTOUR
DE 63KDA,. UNE ETUDE PRECISE DE LA LOCALISATION DE PUS1 PAR IMMUNOCYTOCHIMIE EN MICROSCOPIE
ELECTRONIQUE A PERMIS DE METTRE EN EVIDENCE LA PRESENCE DE PUS1 DANS LE NOYAU, ESSENTIELLEMENT
AU NIVEAU DE LA MEMBRANE NUCLEAIRE, MAIS EGALEMENT DANS LA MITOCHONDRIE. LA PRESENCE
DE PUS1 DANS CES DEUX COMPARTIMENTS CELLULAIRES EXPLIQUE VRAISEMBLABLEMENT L'EXISTENCE
DES DEUX FORMES DE L'ENZYME DANS LA LEVURE. CE TRAVAIL CONSTITUE LA PREMIERE ANALYSE
PHYSICOCHIMIQUE ET ENZYMATIQUE DE PUS1 ET PERMET DE MONTRER QUELLES SONT LES DIRECTIONS
A PRENDRE POUR LES FUTURES RECHERCHES LA CONCERNANT.
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